Bennett et al. 2009

phyA

cgtcatgaaggagattgg
atagaaccgtcaacgctc

P. melaninogenicus

۳۸۹

۵۴

Yoshida et al. 2005

سه ژن­ plo برای سم پیلولازین T. pyogenes، ژن lktA برای لوکوتوکسین F. necrophorum و ژن phyA برای همولایزین P. melaninogenicus منحصر به فرد و اختصاصی بودند. پرایمر ژن ۱۶S rRNA برای شناسایی زیرگروه E. coli متشکل از باکتری­هایی چون E. coli، Hafnia alvei و Shigella spp. طراحی شده است.

باکتری E. coli با ATCC شماره ۳۵۲۱۸، باکتری P. melaninogenicus با ATCC شماره ۲۵۸۴۵، و باکتری­ های T. pyogenes و F. necrophorum بومی به عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. محصولات واکنش زنجیره­ای با الکتروفورز روی ژل آگاروز ۱ درصد از هم تفکیک شده و با μg/mL 5/0 اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی و تحت نور فرابنفش قابل مشاهده شدند. قرار گرفتن محصول واکنش در اندازه مولکولی مورد انتظار به عنوان نتیجه مثبت در نظر گرفته شد.
۳-۷- واکنش زنجیره­ای پلیمراز چندتایی (multiplex PCR) برای باکتری­ های E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum
برای انجام واکنش زنجیره­ای پلیمراز چندتایی، سه باکتری E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum استفاده شدند. محلول ۴۰ میکرولیتری که برای واکنش ساخته شد شامل مواد زیر بود: ۱۳ پیکومول از هر پرایمر، ۱ میلی­مول از هر داکسی نوکلئوتید تری فسفات، ۲ میلی مول کلرید منیزیم، بافر تگ پلیمراز X1، ۴ واحد آنزیم تگ پلیمراز (پارس توس، مشهد، ایران) و ۸ میکرولیتر از DNA نمونه به عنوان الگو.
گرادیانت دمایی ۵۷ تا ۵۹ درجه سانتیگراد برای دمای اتصال استفاده شد و واضح­ترین باندها در دمای ۵۹ درجه سانتیگراد به دست آمد (تصویر ۲). بعد از تجربه چندین شرایط مختلف، واکنش زنجیره­ای پلیمراز چندتایی با شرایط زیر بهینه و انجام شد: ۹۵ درجه سانتیگراد برای ۵ دقیقه، به دنبال آن ۳۰ چرخه ۹۴ درجه سانتیگراد برای ۳۰ ثانیه، ۵۹ درجه سانتیگراد برای ۴۵ ثانیه و ۷۲ درجه سانتیگراد برای ۵۰ ثانیه. از باکتری E. coli با شماره ATCC 35218، و باکتری­ های بومی T. pyogenes و F. necrophorum به عنوان الگو استفاده شد.
۳-۸- بررسی شاخص­ های تولیدمثلی
پایش حیوانات تا هنگام آبستنی مجدد یا تا روز ۲۴۰ پس از زایش ادامه یافت. تعداد تلقیح­ها برای آبستن شدن گاو تا حداکثر ۸ ماه پس از زایش، روزهای باز، دریافت درمان مجدد در معاینه دوم به عنوان شاخص­ های تولیدمثلی بررسی شدند.
۳-۹- آزمون­ها و تحلیل­های آماری
تحلیل آماری داده ­ها با بهره گرفتن از نرم­افزار SAS 9.1 انجام گرفت. تفاوت در شیوع اندومتریت در اولین معاینه (۲۵ تا ۳۵ روز پس از زایش) با دومین معاینه (دو هفته بعد) و تغییرات آنها با آزمون مربع کای^[۲] و تست دقیق فیشر^[۳] آزموده شد. ارتباط باکتری­ های شناسایی شده در اولین و دومین معاینه، و ارتباط بین نوبت نمونه گیری و شناسایی هر باکتری با آزمون دقیق فیشر تعیین شد. ارتباط بین باکتری­ های شناسایی شده توسط آزمون همبستگی مورد تحلیل قرار گرفت. ارتباط ابتلای گاوها به اندومتریت بالینی، آلودگی باکتریایی به صورت کلی یا هریک بتنهایی، قطر گردن رحم، تقارن شاخ­های رحم، وجود لومن رحم، ساختار غالب تخمدان با همدیگر و با شاخص­ های تولیدمثلی چون گروه بندی تعداد تلقیح و درمان دیگر با آزمون دقیق فیشر تعیین شد. تفاوت در میانگین­های وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل­ها در سلول شناسی گردن رحم در ابتلا به اندومتریت، آلودگی به باکتری­ ها به صورت کلی یا هر یک بتنهایی، قطر گردن رحم، تقارن شاخ­های رحم و وجود لومن رحم، ساختار غالب تخمدان با آزمون میانگین t و یا آزمون یک طرفه ANOVA با تست تعقیبی دانکن استفاده شد. ارتباط آلودگی با باکتری­ ها به طور کلی و هر یک بتنهایی و نیز ساختار تخمدان با روزهای باز، تعداد تلقیح و درمان مجدد با آزمون همبستگی مورد بررسی قرار گرفت. ارتباط بین شاخص­ های تولیدمثلی روزهای باز، تعداد تلقیح و درمان مجدد با آزمون همبستگی بررسی شد. در تمامی آزمون­ها P < 0.05 به عنوان معنی­داری مورد توجه قرار گرفت.
گاوها چندین بار به دو گروه تقسیم شدند: PCR مثبت (۱) یا PCR منفی (صفر) برای هر باکتری و برای شکم زایش (شکم اول: ۱ و شکم دوم: صفر). به منظور ارزیابی ارتباط بین حضور باکتری­ ها و شکم زایش با احتمال ابتلا به اندومتریت بالینی، دو مدل رگرسیون لجستیک^[۴] چند متغیره روی داده ­ها انجام شد. متغیر وابسته، اندومتریت بالینی در اولین و دومین معاینه بود. متغیرهای مستقلی که در مدل اولین معاینه استفاده شدند شامل شکم زایش (شکم اول و دوم) و حضور باکتری­ های E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum در اولین معاینه بودند. در دومین مدل، که مربوط به معاینه دوم بود، متغیرهای مستقل شامل شکم زایش (شکم اول و دوم) و حضور باکتری­ های E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum در اولین و دومین معاینه بود. تمامی واکنش­های متقابل دو طرفه به مدل افزوده شد. معنی­داری آماری هنگامی در نظر گرفته شد که P < 0.05 مشاهده می­شد.
فصل چهارم
نتایج
در مجموع از ۱۷۷ گاو انتخاب شده، ۳۰۰ نمونه در دو معاینه (۱۷۲ نمونه در معاینه اول و ۱۲۸ نمونه در معاینه دوم) جمع آوری شد. در مطالعه حاضر برای چهار باکتری T. pyogenes، E. coli، F. necrophorum و P. melaninogenicus واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) استاندارد تنظیم شده و ۳۲ شناسایی مثبت به دست آمد (تصویر ۱). همچنین یک پروتکل multiplex PCR برای سه باکتری­ بیماری­زای اصلی رحم (E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum) طراحی شد و واکنش زنجیره­ای چند تایی باندهای تکی به ترتیب در اندازه­ های ۳۴۰، ۲۷۰ و ۴۰۲ جفت باز تولید کرد، که با اندازه­ های باندهای تولیدی با واکنش زنجیره­ای تکی برای نمونه­ها منطبق بود (تصویر ۲).
۴-۱- معاینه اول
۴-۱-۱- ابتلای به اندومتریت بالینی
ارزیابی ترشحات مهبلی نشان داد که ۶۱ راس از ۱۷۲ گاو (۵/۳۵ درصد) در اولین معاینه (۲۵ تا ۳۵ روز پس از زایش) مبتلا به اندومتریت بالینی (نمره ترشحات مهبلی ۲ و بیشتر) بوده ­اند (جدول ۲). بین ابتلای گاوها به اندومتریت بالینی و قطر بیشتر گردن رحم (بیشتر از ۵ سانتی­متر)، عدم تقارن شاخ­های رحم و وجود لومن رحم ارتباط معنی­دار وجود داشت. ابتلای به اندومتریت با ساختار تخمدانی، نیاز به درمان مجدد و تعداد تلقیح ارتباط معنی­داری نداشت. میانگین وضعیت بدنی در گاوهای سالم و مبتلا به اندومتریت بالینی تفاوت معنی­دار نداشت. هر چند میانگین روزهای باز در گاوهای مبتلا بیشتر بود اما این تفاوت معنادار نبود. درصد نوتروفیل­ها در سلول شناسی گردن رحم گاوهای مبتلا به اندومتریت بالینی به طور معناداری بیشتر بود (جدول ۳).
۴-۱-۲- باکتری شناسی
در ۱۷ راس از ۱۷۲ گاو، ۲۵ مورد آلودگی باکتریایی به روش PCR شناسایی شدند (جدول ۴)، ۴ گاو برای باکتری E. coli، ۱۱ گاو برای باکتری T. pyogenes و ۱۰ گاو برای باکتری F. necrophorum مثبت بودند که از این تعداد ۸ راس عفونت مشترک با باکتری T. pyogenes داشتند و ارتباط آن­ها معنی­دار بود (جدول ۵).
آلودگی کلی باکتریایی در نمونه­های رحمی با ابتلای به اندومتریت بالینی ارتباط معنی­دار داشت. ارتباط بین ابتلای به اندومتریت با حضور باکتری­ T. pyogenes، F. necrophorum و موارد مشترک این دو باکتری معنی­دار اما با حضور باکتری E. coli معنی­دار نبود. آلودگی کلی باکتریایی نمونه­های رحمی یا هریک از باکتری­ ها به تنهایی ارتباط معنی­داری با روزهای باز، تعداد تلقیح و دریافت درمان مجدد (جدول ۷)، وضعیت بدنی گاو و ساختار تخمدان نداشت. آلودگی کلی باکتریایی با افزایش قطر گردن رحم و عدم تقارن شاخ­های رحم ارتباط داشت اما موجب ایجاد لومن در شاخ رحم نشده بود. آلودگی با T. pyogenes موجب افزایش قطر گردن رحم، عدم تقارن در شاخ­ها و وجود لومن شاخ رحم شده بود. آلودگی با F. necrophorum با افزایش قطر گردن رحم و عدم تقارن در شاخ­های آن همراه بود اما با وجود لومن شاخ رحم ارتباطی نداشت. آلودگی مشترک با دو باکتری T. pyogenesis و F. necrophorum با عدم تقارن در شاخ­های رحم ارتباط معنی­دار داشت اما با افزایش قطر گردن رحم و وجود لومن رحم ارتباطی نداشت. ارتباط معنی­دار بین یافتن باکتری E. coli و هیچ کدام از شاخص­ های افزایش قطر گردن رحم، عدم تقارن در شاخ­های رحم و وجود لومن شاخ رحم وجود نداشت. آلودگی کلی باکتری­ ها و یا هریک از باکتری­ ها به تنهایی تغییر معناداری در میانگین وضعیت بدنی، روزهای باز (جدول ۹) و درصد نوتروفیل­ها ایجاد نکرده بود (جدول ۱۰).
هیچ نمونه مثبتی از باکتری P. melaninogenicus شناسایی نشد.
۴-۱-۳- شاخص ­ها و عوامل تولیدمثلی
قطر بیشتر گردن رحم با ابتلا به اندومتریت بالینی در ارتباط بود. ارتباط قطر بیشتر گردن رحم با تعداد کلی یافته­های باکتریایی در نمونه­های رحمی، یافتن باکتری­ های T. pyogenesis و F. necrophorum معنی­دار اما با موارد مشترک این دو باکتری و یافتن باکتری E. coli معنی­دار نبود. در گروهی که قطر گردن رحم با اندازه بیش از ۵ سانتی­متر داشتند، عدم تقارن شاخ­ها، وجود لومن رحم و دریافت درمان مجدد به طور معنی­داری بیشتر بود. قطر گردن رحم با ساختار تخمدان و تعداد تلقیح ارتباط معنی­داری نداشت. وضعیت بدنی و روزهای باز با قطر گردن رحم در ارتباط نبود اما درصد نوتروفیل­ها در سلول شناسی گردن رحم در گروه با قطر بیش از ۵ سانتی­متر به طور معنی­داری بیش از گروه با قطر کمتر از ۳ سانتی­متر بود
(جدول ۱۱).
بین عدم تقارن دو شاخ رحم و ابتلای به اندومتریت بالینی ارتباط معنی­دار وجود داشت. عدم تقارن در شاخ­های رحم با تعداد کلی یافته­های باکتریایی، یافتن باکتری­ های T. pyogenesis و F. necrophorum و موارد مشترک این دو باکتری معنی­دار اما با یافتن باکتری E. coli معنی­دار نبود. عدم تقارن دو شاخ با قطر گردن رحم ارتباط معنادار داشت و با وجود لومن شاخ رحم، ساختار تخمدان، دریافت درمان مجدد و تعداد تلقیح ارتباط معنی­دار نداشت. میانگین وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیل­ها در سلول شناسی گردن رحم در دو گروه با شاخ رحم متقارن و نامتقارن متفاوت نبود (جدول ۱۲).
بین وجود لومن شاخ رحم و اندومتریت بالینی ارتباط معنی­دار وجود داشت. وجود لومن شاخ رحم با تعداد کلی یافته­های باکتریایی در نمونه­های رحمی ارتباط معنی­دار نداشت. ارتباط بین وجود لومن شاخ رحم با یافتن باکتری­ T. pyogenesis معنی­دار اما با یافتن باکتری­ های F. necrophorum و E. coli و موارد مشترک باکتری­ های T. pyogenesis و F. necrophorum معنی­دار نبود. وجود لومن شاخ رحم با قطر گردن رحم ارتباط معنا دار داشت و با عدم تقارن دو شاخ رحم، ساختارهای تخمدان، نیاز به درمان مجدد و تعداد تلقیح ارتباط معنی­داری نبود. میانگین وضعیت بدنی و روزهای باز در دو گروه دارای لومن و بدون لومن شاخ رحم تفاوت معناداری نداشت اما درصد نوتروفیل­ها در سلول شناسی گردن رحم آنها که لومن داشتند به طرز معنی­داری بالاتر بود (جدول ۱۳).
میانگین وضعیت بدنی در گاوهای مبتلا به اندومتریت بالینی، گاوهای آلوده به باکتری به صورت کلی، یا هر یک از باکتری­ های T. pyogenesis، F. necrophorum و E. coli، با قطر گردن رحم، تقارن دو شاخ رحم و وجود لومن آن، تعداد تلقیح و نیاز به درمان مجدد تفاوت معنی­دار نداشت. تنها در گروهی که تخمدان آنها هیچ ساختار قابل لمسی نداشت میانگین وضعیت بدنی به طور معنی­داری کمتر از گروهی بود که تخمدان آنها جسم زرد یا کیست داشت (جدول ۱۴).