هنگامیکه سالمونلا تایفی مزمن شود، در داخل کیسه صفرا کلونیزه می شود و باکتری از طریق مدفوع از بدن خارج می شود و سالمونلا را می تران از طریق کشت مدفوع جدا نمود(۴,۶).
در مورد عفونت های گاستروانتریت و انتروکولیت باید از بیمار کشت مدفوع صورت پذیرد اما از بیماران مشکوک به تب روده ای باید کشت خون صورت گیرد. سروتایپینگ به این صورت انجام می شود که یک قطره از آنتی سرم O بر روی لام ریخته و با یک کلونی از باکتری مخلوط می کنیم، اگر آگلوتیناسیون بعد از گذشت یک الی دو دقیقه صورت گرفت، مثبت بودن تست را مشخص می کند. در سالمونلا انتریتیدیس، سالمونلا پاراتایفی C و سالمونلا تایفی آنتی ژن کپسولی بر روی آنتی ژن پیکری قرار می گیرد در نتیجه ممکن است باکتری با هیچکدام از آنتی سرم های O واکنش ندهد و لخته ایجاد نشود(۱۹,۲۱) .
ج) کشت خون
سالمونلا تایفی بر روی محیط کلیگر آیرون آگار در قسمت شیب دار محیط به صورت لکه های سیاه رنگ، SH₂ تولید می کند. می توان از طریق تست لیزین، سالمونلا را از سیتروباکتر تشخیص داد. سالمونلا در تست لیزین دآمیناز^[۴۲] منفی بوده اما در تست لیزین دکربوکسیلاز^[۴۳] مثبت است.
برای انجام کشت خون، باید از بیمار حدود ۱۰ میلی لیتر در هنگام تب خون گرفت و خون را در محیط تریپتیکاز سوی براث تزریق نمود و محیط را در داخل انکوباتور در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت یک شبانه روز قرار داد. در تب روده ای کشت خون در هفته اول مثبت می باشد(۱۹-۲۱).

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۱-۲-۱۰. پیشگیری و کنترل
معیار های بهداشتی برای جلوگیری از آلودگی غذا و آب توسط جوندگان و سایر حیواناتی که سالمونلا را از خود دفع می کنند، باید در نظر گرفته شود. محصولات طیور، گوشت و تخم مرغ های آلوده باید به خوبی پخته شوند. افراد ناقل نباید در کار تهیه مواد غذایی مشغول شوند و نظارت و احتیاط های شدید بهداشتی باید انجام شود.
دو واکسن تیفوئید هم اکنون در ایالات متحده آمریکا در دسترس می باشد. یک واکسن خوراکی تخفیف حدت یافته و یک واکسن از کپسول پلی ساکاریدی Vi که داخل ماهیچه تزریق می گردد. واکسیناسیون برای افرادی که به مناطق اندمیک سفر می کنند به خصوص آنهایی که در نظر دارند به مناطق روستایی که انتخاب های غذایی محدودی دارند بروند، توصیه می شود. هر واکسن کارایی در حدود ۵۰ تا ۸۰% دارد. زمان مورد نیاز برای واکسیناسیون اولیه و محدودیت های سنی برای هر واکسن متفاوت می باشد و افراد باید با وب سایت پیشگیری و کنترل بیماری ها مراجعه کرده و یا با یک کلینیک مخصوص مسافران مشورت نمایند تا بر اساس آخرین اطلاعات مربوط به واکسن عمل شود(۴).
۱-۲-۱۱، ایمنی
عفونت با سالمونلا تایفی و سالمونلا پاراتایفی معمولا درجاتی از ایمنی را در افراد ایجاد می نماید. عفونت مجدد می تواند اتفاق بیوفتد اما نسبت به عفونت نخست، شدت کمتری دارد. آنتی بادی ها در گردش خون علیه آنتی ژن های O و Vi در ایمنی علیه عفونت و بیماری نقش ایفا می کند. البته امکان عود بیماری ظرف دو الی سه هفته و با وجود حضور آنتی بادی ها امکان پذیر می باشد. IgA ترشحی می تواند جلوی اتصال سالمونلا ها را به اپیتلیوم روده بگیرد.
افرادی که هموگلوبین نوع S/S دارند و دارای بیماری سلول های داسی می باشند، حساسیت بیشتری به عفونت های سالمونلایی به خصوص استئو میلیت دارند. افرادی که هموگلوبین A/S دارند( خصلت سلول های داسی) بیش از افراد عادی( آنهایی که هموگلوبین نوع A/A دارند) حساس هستند(۴).
۱-۲-۱۲، درمان
در پاکستان،بنگلادش،هند،ویتنام،آفریقاوخاورمیانه درطی سال­های۱۹۸۰تا۱۹۹۰ میلادی، اپیدمی هایی در اثر سالمونلا تایفی مقاوم به همه ی دارو های خط اول درمان که شامل کوتریموکسازول، آمپی سیلین و کلرامفنیکل بودند، ایجاد شد. سویه های سالمونلا تایفی که به کلرافنیکل مقاوم هستند به تتراسایکلین، استرپتومایسین و سولفونامید نیز مقاومت از خود نشان می دهند و برای درمان می توان از آنتی بیوتیک های موثر نظیر کوتریموکسازول و آموکسی سیلین استفاده نمود(۱۸).
برای­ درمان حصبه و شبه حصبه ازآنتی بیوتیک ها استفاده می شود که از این آنتی بیوتیک ها می توان به کوتریموکسازول، کینولون ها، آزیترومایسین، آزترونام، بتالاکتام و کلرامفنیکل اشاره نمود. به علت ایجاد عوارض و مقاومت بالا به کلرامفنیکل، از سال ۱۹۷۲ میلادی به بعد دیگر از این آنتی بیوتیک در درمان حصبه استفاده نمی شود.
بیمارانی که دارای مشکلات تغذیه ای هستند باید از غذاهای پر کالری، کم حجم و سالم استفاده کنند. برای جلوگیری از تب طولانی و کم آبی ناشی از اسهال، به بیماران نوشیدن مایعات توصیه می شود اما در مواردی که این کم آبی شدید است باید بیماران مایعات را از طریق ورید دریافت کنند(۲۲).
مواردی از استفاده سالمونلا به عنوان یک آلوده کننده بیولوژیک وجود دارد به این علت که سرعت رشد و تکثیر سالمونلا بالاست و سویه هایی از سالمونلا تایفی می توانند سبب آلودگی مواد غذایی شوند.
هم اکنون برای درمان حصبه از سفالوسپورین های نسل سوم مثل سفتازیدیم و سفتریاکسون و فولورو کینولون ها مثل سیپروفلوکساسین و افلوکساسین استفاده می شود. جهت درمان سویه های مقاوم به کینولون، آزیترومایسین یا سفتریاکسون استفاده می گردد. البه شایان ذکر است در برخی از نقاط جهان درصد بالای از مقاومت سویه های سالمونلا به فلوروکینولون و سفالوسپورین های نسل سوم دیده شده است هنگامیکه این شرایط پیش می آید باید برای درمان این سویه های مقاوم از آزترونام و آزیترومایسین اسفاده نمود. هنگامی که باکتری به چند دارو مقاوم^[۴۴] باشد برای درمان باید از یک سفکسیم یا فلوروکینولون استفاده نمود در حالیکه برای جداسازی باکتری حساس باید از فلوروکینولون ها مثل سپیروفلوکساسین و افلو کساسین استفاده نمود(۲۳).
۱-۳ – مروری بر روش های تایپینگ باکتری ها
تیپ بندی باکتری ها به دو صورت انجام می شود که به صورت زیر می باشد:

1. 1. فنوتایپینگ: که بر اساس ویژگی های ظاهری باکتری ها می باشد مثل: کشت، تست های بیو شیمیایی، فاژتایپینگ و آنتی بیوگرام.

1. 1. ژنوتایپینگ: که از میزان دقت و حساسیت بالایی نسبت به فنوتایپینگ بر خوردار است و این تکنیک ها بر پایه ی ژنوم میکرو ارگانیسم ها شکل گرفته اند مثل: MLST^[45]، PFGE، MLVA، Plasmid Profiling، REP-PCR^[46]، ERIC-PCR^[47]، PCR-RFLP، AFLP^[48]، ^[۴۹]AP-PCR،RAPD-PCR^[50]و Multiplex PCR.

البته در میان تکنیک های ژنوتایپینگ دو تکنیک MLVA و MLST از همه جدیدتر بوده است. البته شایان ذکر دو تکنیک Real Time- PCR و تکنیک LAMP^[51] برای تشخیص میکرو ارگانیسم ها استفاده می شود. البته در این میان LAMP دارای سرعت بالا و هزینه پایین نسبت به Real Time- PCR می باشد(۲۳).
در ابتدا برای تشخیص باکتری ها و بررسی های اپیدمیولوژیکی از تست های سرولوژی استفاده شد. البته تست های سرولوژی با مشکلاتی اعم از هزینه بالای تولید و مصرف آن، تنوع وسیع خصوصیات آنتی ژنتیکی و نیاز به استفاده از طیف وسیعی از آنتی بادی به خصوص در هنکام استفاده از این تست برای شناسایی اشرشیا کلی، به همین دلیل تکنیک های مولکولی جایگزین تست های سرولوژی شده اند.
نگرش دانشمندان و محققان با شروع عصر مولکولی با کشف ژنوم از ویژگی های ظاهری باکتری( فنوتیپ) به به خصوصیات ژنتیکی و باطنی باکتری( ژنوتیپ) تغییر یافته است. البته تکنیک های ژنوتایپینگ خود به دو دسته تقسیم می شوند که به صورت زیر می باشد:

1. 1. روش های ژنوتایپینگی که بر پایه ی تکثیر و همانند سازی DNA شکل گرفته اند که شامل: انواع مختلف PCR، MLVA و MLST

1. 1. تکنیک هایی که بر پایه ی تکثیر و همانند سازی DNA نمی باشند که شامل: PFGE و FISH^[52]

تا کنون از تکنیک های مولکولی مختلفی جهت ژنوتایپینگ سویه مختلف سالمونلا انتریکا سرووار انتریتیدیس صورت گرفته که به تفصیل در فصل دوم و پنجم توضیح داده خواهد شد.
تمام این تکنیک هایی مولکولی دارای معایب و مزایایی نسبت به یکدیگر می باشند. MLVA یکی از روش های ژنوتایپینگ سریع و کم هزینه می باشد که مدت زمان زیادی نیست که پا به عرصه وجود کذاشته است و با توجه به مزایایی که نسبت به سایر روش های مولکولی دارد، امید می رود این تکنیک جایگزین سایرروش های ژنوتایپینگ­گران قیمت شود.البته شایان­ذکر است که­بحث مقایسه ی سایر روش های مولکولی از گنجایش این پایان نامه بدلیل گستردگی این روش ها، خارج است و سعی شده تا تکنیک MLVA را به طور کامل معرفی کرده و آنرا با سایر روش های مولکولی مقایسه کنیم و مزایا و معایب آنرا با سایر روش های مولکولی مشخص کنیم(۷).
۱-۳-۱- اصول و مبانی روش MLVA
MLVA بر پایه ی توالی های تکرار شونده^[۵۳] می باشد. توالی های تکرار شونده درداخل ژنوم ارگانیسم ها می باشند که دارای الگوهایی از اسید نوکلئیک( DNA یا RNA) می باشند که در چندین نسخه^[۵۴] در ژنوم ارگانیسم ها وجود دارند. به طور کلی این توالی ها ی تکرار شونده به دو گروه اصلی تقسیم می شوند که شامل: ۱) تکرار های پراکنده مثل SINEs و LINEs 2) تکرار های پشت سرهم که شامل میکرو ماهواره ها^[۵۵]، ماهواره ها^[۵۶] و مینی ماهواره ها^[۵۷] می باشند. هنگامی که دو یا تعداد بیشتری از نوکلئوتید ها در کنار هم تکرار گردند، توالی تکرار های پشت سرهم شکل می گیرد به عنوان مثال توالی GTACGTACGTAC که توالی تکرار شونده ی آن GTAC است. اگر اندازه ی توالی تکرار شونده بین ۱۰ تا ۶۰ نوکلئوتید باشد، این توالی را مینی ماهواره و اگر این اندازه از ۶۰ نوکلئتید بزرگتر باشد آنرا ماهواره و اگر این اندازه از ۱۰ نوکلئوتید کوچکتر باشد آنرا میکرو ماهواره نام گذاری می کنند(۲۴).
شکل ۱-۴، در تصویر بالا یک نمای شماتیک از VNTR ها یا همان توالی های تکرار شونده دیده می شود که هر مربع آبی نشان دهنده یک توالی تکرار شونده می باشد. VNTR ها در هر سویه باکتریایی متفاوت می باشند.
VNTR یا تکرار های پشت سرهم با تعداد متغییر در اصطلاح به تکرار های پشت سرهمی گفته می شود که در یک ارگانیسم در مقایسه با سایر جمعیت های آن از لحاظ تعداد تکرار متفاوت می باشند. این ویژگی جالب سبب شده از زمان کشف VNTR، از این توالی های خاص در زیست شناسی، تحقیقات پزشکی جنایی^[۵۸]، انگشت نگاری DNA^[59]و ژنتیک استفاده می نمایند. برای اولین بار VNTR ها در ژنوم سلول های یوکاریوتی مثل انسان پیدا شد ولی این توالی ها در ژنوم سلول های پروکاریوتی مثل باکتری ها نیز وجود دارند. VNTR ها در جنس و گونه های مختلف با هم متفاوت می باشند و هر VNTR مخصوص به خود همان گونه و جنس است و با VNTR گونه یا جنس دیگر متفاوت می باشد. لیز خوردن آنزیم DNA پلیمراز در حین همانند سازی ژنوم باعث ایجاد VNTR ها می شود به همین دلیل در تعداد تکرار های VNTR تنوع وجود دارد(۲۵و۲۶).
همانطور که ذکر شد MLVA بر اساس VNTR ها شکل گرفته است. این تکنیک به تازگی برای ژنوتایپینگ باکتری ها استفاده شده است و خود را به عنوان یک تکنیک قدرتمند با حساسیت بالا در میان سایر تکنیک های مولکولی مطرح کرده است. معمولا برای انجام MLVA تعداد هفت یا بیشتر لوکوس^[۶۰] VNTR از ژنوم باکتری انتخاب می گردد. پس از انجام PCR و الکتروفورز، ما تعداد تکرار های هر لوکوس VNTR را بدست می آوریم. در اصطلاح به این مجموعه ی تعداد تکرار ها را الگوی اللی( پروفایل اللی) می نامند به عنوان مثال پروفایل اللی نمونه شماره یک به صورت ۱-۲-۵-۶-۳-۴-۷ و برای نمونه شماره ی دو به صورت ۳-۲-۶-۵-۴-۱-۷ می باشد البته برای آنکه معنای پروفایل اللی را بهتر متوجه شویم می توان گفت پروفایل اللی مانند یک بارکد برای هر نمونه می باشد و با ذخیره سازی این داده ها در بانک های اطلاعاتی، امکان مقایسه این داده ها با سایر داده ها و حتی پردازش مجدد این داده ها وجود دارد(۷).
شکل ۱-۵، تصویر بالا پروفایل اللی مربوط به دو سویه ی باکتریایی را نشان می دهد. مربع های رنگی توالی های مختلف VNTR را نشان می دهد.
۱-۲-۳- کلمات و اصطلاحات کاربردی در MLVA
بعد از انجام کارهای عملی مربوط به MLVA و ایجاد پروفایل اللی برای هر نمونه، نوبت به استفاده از مجموعه ای از الگوریتم های ریاضی می رسد که با بهره گرفتن از این الگوریتم ها می توان به تجزیه و تحلیل روابط فیلوژنتیکی و قرابت بین ایزوله ها پی برد. در MLVA برای بررسی ایزوله های جمعیتی از الگوریتم های MST^[61] استفاده می شود، البته از MST در تکنیک MLST نیز استفاده می شود. برای نخستین باردر سال ۱۹۶۰ میلادی مهندسان شهرداری برای انتخاب کوتاهترین مسیر ها برای نصب خطوط برق و مخابراتی یا انجام لوله کشی آب و فاضلاب، از این الگوریتم ها استفاده نمودند. سپس از این الگوریتم ها در زیست شناسی برای ترسیم کوتاهترین مسیر های تکاملی استفاده شد. امروزه از این الگوریتم ها برای تجزیه و تحلیل داده های تکنیک های MLST و MLVA استفاده می شود(۲۷).
شکل ۱-۶، در تصویر بالا آنالیز MLVA بوسیله MST را در یک سویه ی باکتریایی مشاهده می کنید. ایزوله هایی که در خرج ازخوشه های رنگی هستند،یکSingleton می باشند و هر خوشه رنگی نشان دهنده یک کلونال کمپلکس^[۶۲] می باشد.
اگر دو ایزوله در یک لوکوس VNTR در پروفایل اللی خود با هم تفاوت داشته باشند، در اصطلاح نسبت به هم، SLV^[63] می باشند به عنوان مثال ایزوله ی شماره یک با پروفایل اللی ۳-۲-۱-۷-۲-۴-۳ نسبت به ایزوله ی شماره دو با پروفایل اللی ۳-۲-۱-۷-۲-۴-۲، SLV می باشد. حال اگر دو ایزوله در دولوکوسVNTRدرپروفایل اللی خودباهم تفاوت داشته باشند، در اصطلاح نسبت به یکدیگر، DLV^[64]هستند. هرعدد غیر مشابه ای نشان دهنده ی یک الل جدید می باشد و تنها در اینجا تفاوت در جایگاه های لوکوسی دارای اهمیت می باشد. بنیان گذار زیر گروه^[۶۵] در اصطلاح به ایزوله ای گفته می شود که حداقل دو SLV از آن منشاء گرفته است. کلونال کمپلکس یا دودمان^[۶۶] در اصطلاح به یک ایزوله ی مرکزی همراه با SLV و DLV های مربوط به آن گفته می شود. اعضای مربوط به یک کلونال کمپلکس قرابت ژنتیکی نزدیکی به هم دارند و احتمالا از یکدیگر مشتق شده اند. Singleton در اصطلاح به ایزوله هایی گفته می شود که در هیچ کلونال کمپلکسی قرار ندارند یا به عبارتی دارای بیش از دو تفاوت در جایگاه های لوکوسی در پروفایل اللی خود هستند. جمعیت های باکتریایی از تعدادی singleton و کلونال کمپلکس تشکیل شده اند. البته شایان ذکر است که MST نشان دهنده زمان تکامل نمی باشد و تنها ارتباط تکاملی ایزوله ها را نشان می دهد(۲۷).
۱-۳-۳- مزایای MLVA نسبت به سایر روش های ژنوتایپنگ
هر تکنیک ژنوتایپینگ دارای مزایا و معایبی می باشد. مزایای بیشمار تکنیک MLVA سبب شده که این تکنیک جای خود را در میان سایر تکنیک های ژنوتایپینگ باز کند و بیشتر مورداستفاده ی میکروبیولوژیست­هاو اپید میولوژیست­ها ­قرارگیرد. به­ طور خلاصه­ مزایای ­تکنیکMLVA رادر شکل ۱-۷ مشاهده می نمایید.
شکل ۱-۷، در تصویر بالا تعدادی از مزایای MLVA را به طور خلاصه مشاهده می کنید.
مزایای تکنیک MLVA عبارت است از:

1. 1. هزینه^[۶۷]: مشکلاتی که همواره پیش روی طرح های تحقیقاتی میباشد، هزینه ی انجام این طرح ها است و این هزینه ها در کشورهای در حال توسعه دارای اهمیت می باشد. MLVA یک تکنیک مبتنی بر PCR است و دارای هزینه های به مراتب کمتر نسبت به سایر تکنیک ها از جمله PFGE و MLST می باشد. در تکنیک PFGE نیاز به دستگاه ها و مواد گرانقیمت می باشد و در MLST ممکن است به علت تعیین توالی ^[۶۸]محصولات PCR هزینه ها به اندازه ی تکنیک PFGE یا بیشتر از PFGE شود(۷).

1. راحتی و سادگی انجام آن^[۶۹]: مزیت تکنیک MLVA اینست که نیاز به تبحر و تخصص خاصی ندارد. موفقیت MLVA نسبت به سایر تکنیک های مبتنی بر PCR آنست که این تکنیک ساده می باشد و آنالیز داده های آن نیز سریع است(۷, ۲۴) (شکل ۱-۸).