۲-۷-کشت بافت بیضه
قطعات بافت بیضه در گروه های کنترل و انجمادیI و II بر روی آگار به مدت ۲۰ ساعت کشت داده شدند (۴۵).
۲-۷-۱-آماده سازی آگار
آگار مصرفی با غلظت ۱۵% با بهره گرفتن از آب مقطر اتوکلاو شده تهیه و این محلول در پلیت^[۵۳] ۶ سانتی متری ریخته شد و سپس به مدت چند ساعت در یخچال قرار گرفت تا به حالت جامد در آید، قطعات آگار جامد با بهره گرفتن از تیغ بیستوری به قطعات یک در یک سانتی متری بریده شد (۴۵). لازم به ذکر است که آگار جامد به مدت یک ماه در یخچال قابل نگهداری است.
جهت آماده سازی قطعات برش خورده ی آگار برای کشت بافت در ، سه قطعه آگار در هر چاهک پلیت شش چاهکی^[۵۴] قرار گرفتند و سپس محیط کشت به میزانی اضافه شد که به طور کامل سطح آگار را بپوشاند. پلیت ها به مدت یک روز در انکوباتور با دمای ۳۴ درجه سانتیگراد و فشار ۵% CO2 قرار گرفتند تا محیط کشت کاملا جایگزین آب موجود در آگار شود (۴۵).

۲-۷-۲-آماده سازی محیط کشت
جهت کشت قطعات بافتی در گروه های کنترل و هر دو گروه انجمادی، محیط پایه ی RPMI^[55] حاوی ۱۰% سرم KOSR^[56] تهیه شد.
۲-۷-۲-۱-روش تهیه محیط RPMI
برای ساخت ۱۰۰ میلی لیتر محیط کشت RPMI، مواد زیر به ترتیب به آب دیونیزه اضافه شدند.
Deionized water 100 ml
RPMI (Gibco; Paisley; UK) 1/042 gr
Penicillin / Streptomycin (Gibco; Paisley; UK) 1ml
NaHCo3 (Sigma; MO; USA) 0/2 gr
سپس pH محیط فوق توسط دستگاه pH متر، بین ۶/۷-۴/۷ تنظیم شد و توسط فیلتر دارای منافذ با قطر ۲۲/۰ میکرومتر فیلتر و در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد.
۲-۷-۳-کشت بافت بیضه
پس از ۲۴ ساعت، محیط درون چاهک ها به طور کامل خارج شد و حدود ۳ میلی لیتر محیط کشت تازه به هر چاهک اضافه گردید به طوری که محیط کشت تا چهار پنجم ارتفاع آگار رسید (۴۵)، سپس ۲ قطعه بیضه بر روی هر قطعه برش آگار قرار داده شد و به مدت ۲۰ ساعت در دمای ۳۴درجه سانتی گراد و فشار ۵% CO2 انکوبه شد.
قطعات بافتی در گروه های کنترل و انجمادی، پس از ۳ و ۲۰ ساعت برداشته شدند و ارزیابی های هیستولوژیک، آپوپتوز و مولکولی بر روی آنها انجام شد.
۲-۸-ارزیابی ژن های آپوپتوزی
۲-۸-۱-نگهداری بافت در محلولRNA-later
RNA later^[57] محلول آبی و غیر سمی با خاصیت نفوذ سریع در بافت است، که مانع تخریب بافت و آسیب رسانی به RNAسلولی می شود. باید بافت ها پیش از قرارگیری در RNA later به قطعات کوچکتر از ۵ میلی متر بریده شوند و به ازای هر قطعه ی بافتی، ۵ حجم RNA later استفاده می گردد. نمونه ها پس از قرار گرفتن در RNA later برای مدت نامحدود در دمای ۸۰- درجه ی سانتیگراد قابل نگه داری هستند
۲-۸-۲-استخراج RNA با بهره گرفتن از ترایزول
۲-۸-۲-۱-هموژن کردن بافت^[۵۸]
جهت هموژن کردن بافت، به ازای هر ۳۰ میلی گرم بافت، ۵۰۰ میکرولیتر ترایزول اضافه شد و با ایجاد ضربه با تیغ بیستوری، بافت به قطعات کوچکتری تبدیل گردید. سپس ازطریق ورتکس کردن، بافت به طور کامل هموژن شد و در نهایت سوسپانسیون حاصل به مدت ۵ دقیقه بر روی یخ قرار گرفت.
۲-۸-۲-۲-مرحله ی جداسازی^[۵۹]
۱۰۰ میکرولیتر کلروفرم سرد به سوسپانسیون سلولی افزوده شد، سپس ویال به شدت تکان داده شد تا محلولی به رنگ صورتی- شیری حاصل گردد و سوسپانسیون حاصل به مدت ۵ دقیقه بر روی یخ قرار گرفت. در مرحله آخر نمونه ها به مدت ۱۵ دقیقه در دستگاه سانتریفوژ با دمای ۴ درجه ی سانتیگراد و g12000 قرار گرفتند.
۲-۸-۲-۳-رسوب^[۶۰]RNA
پس از اتمام سانتریفوژ، فاز رویی ویال ها که حاویRNA بود به یک ویال دیگر انتقال داده شد و هم حجم آن ایزوپروپانول^[۶۱] به آن اضافه گردید و به آرامی تکان داده شد، سپس نمونه به مدت یک ساعت در فریزر قرار گرفت. پس از خارج نمودن نمونه از فریزر، نمونه به مدت ۱۴ دقیقه و با دور g12000 و با دمای ۴ درجه ی سانتیگراد سانتریفوژ شد. پس از سانتریفوژ کردن رسوب کمرنگ RNA در کف ویال تشکیل گردید
۲-۸-۲-۴-شستشو^[۶۲]RNA
در این مرحله، اتانول ۷۰% به رسوب RNA اضافه شد و نمونه به مدت ۵ دقیقه با دمای ۴ درجه ی سانتیگراد و دور g 7500 سانتریفوژ گردید و سپس رسوب ویال ها به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه در زیر هود قرار گرفت تا کاملا خشک شود و در آخر به هر ویال ۱۵ میکرولیتر آب ملکولی اضافه شد.
لازم به ذکر است کلیه ی مراحل استخراج RNA بر روی یخ و زیر هود شیمیایی و با بهره گرفتن از وسایل RNase free انجام شد.
۲-۸-۳-بررسی کیفی RNA های استخراج شده
این مرحله از کار با بهره گرفتن از دستگاه نانودراپ انجام شد بدین منظور ابتدا دستگاه با یک میکرولیتر آب مقطر صفر شد و سپس یک میکرولیتر نمونه ی RNA بر روی دستگاه قرار گرفت و OD^[63] آن خوانده شد. حداکثر جذب RNA در طول موج ۲۶۰ نانومتری است و در طول موج ۲۸۰ نانومتری پلی‌ساکاریدها بیشترین جذب را دارند، بنابراین تعیین نسبت ۲۶۰ به ۲۸۰ درجه خلوص RNA را مشخص می کند (باید OD بین ۲-۸/۱) باشد.
۲-۸-۴-تیمار نمونه یRNA با بهره گرفتن از DNase1 جهت حذف آلودگی ژنومی
اگر غلظت RNA بیش از ۱۰۰۰ نانو گرم در یک میکرولیتر بود ابتدا با رقیق سازی RNA غلظت آن به پایین تر از ۱۰۰۰ نانو گرم در یک میکرولیتر رسانده می شود و سپس به ۱۰ میکرولیتر از RNA رقیق شده مواد زیر، اضافه می گردد.
DNAase1 2 µl
۱۰X Reaction Buffer 2 µl
Ribolouck (20 U/ML) 2 µl
Water 4 µl
Total 20 µl
مخلوط فوق به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۳۷ درجه بر روی ترموستات قرار داده شد و پس از این زمان، ۲ میکرولیتر EDTA به نمونه ها اضافه گردید.
۲-۸-۵-سنتز cDNA
با بهره گرفتن از نسخه برداری معکوس ^[۶۴]RT-PCR) (، رشته DNA از روی الگوی RNA ساخته شد. به همین منظور در این پژوهش از کیت ساخت cDNA تک رشته ای^[۶۵] استفاده گردید.
برای سنتز cDNA از RNA مراحل زیر به ترتیب انجام شد و به هر لوله مواد زیر اضافه شد:
Total RNA 11µl
Random Hexamer (0/2 µg/µl) 1µl
Total 12 µl
– مخلوط حاصله به طور مختصر سانتریفوژ و به مدت ۵ دقیقه در دمای ۷۰ درجه سانتیگراد انکوبه شد.
– سپس نمونه‌ها بر روی یخ قرارداده شدند و مواد زیر به ترتیب به آنها اضافه شد:
Reaction buffer (5x) 4 µl
Ribonuclease inhibitor (20 U/ML) 1 µl