ASSR (anchored simple sequence repeats)
Wang et al. (1998)
۲-۱۱- منابع تغییرات و چند شکلی
تغییر نرخ تکاملی درون ریزماهواره‌ها به طور قابل توجهی بیشتر از انواع دیگر DNA میباشد از این رو احتمال چندشکلی در این توالی‌ها بیشتر است منبع تغییرات در باندهای بدست آمده از نشانگر ISSR می‌تواند به یکی از دلایل زیر یا ترکیبی از آنها نسبت داده شود:
۲-۱۱-۱- نمونه DNA
سرایش آنزیم DNAپلیمراز در طول رونویسی DNA و شکست در تعمیر mismatch به عنوان مکانیسم برای ایجاد تفاوت در توالی‌های تکراری ساده یا SSR قلمداد می‌شود. جهش در نقطه اتصال آغازگر همچون RAPD سبب تشکیل یا عدم تشکیل باند و نمرات ۰ و ۱ می‌شود. حذف و قرارگرفتن درون نواحی تکراری ساده به غیبت باند یا چندشکلی طویل بسته به تشکیل اندازه قطعه قابل تکثیر منجر می‌شود. تفاوت در تعداد نوکلئوتیدها درون تکرارهای ریزماهواره‌ها به چند شکلی طویل منجر خواهد شد وقتی از آغازگر انکورد شده در انتهای ۵َ استفاده شود.
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۲-۱۱-۲- طبیعت آغازگرهای مورد استفاده:
سطح چند شکلی به انکورد شدن یا نشدن، انکورد شدن در انتهای ۳َ یا ۵َ و توالی آغازگر مورد استفاده بستگی دارد. زمانی که از آغازگرهای انکورد نشده استفاده می‌شود باندهای واضح و تمیز به دلیل تمایل آغازگر به سرایش بین واحدهای تکراری در حین تکثیر جای خود را به باندهای ضعیف می‌دهند. وقتی آغازگر در انتهای َ۵ انکورد می‌شود فراورده‌های چند شکل بیشتری تکثیر شده می‌شود. معمولاً آغازگرهای دی نوکلئوتید انکورد شده در دو انتهای َ۳ و ۵َ چند شکلی بیشتری نشان می‌دهند (Joshi et al., 2000; Nagaoka and Ogihara, 1997). آغازگرهای انکورد شده در انتهای ۳َ در مقایسه با آغازگرهای انکورد شده در انتهای ۵َ باندهای شفاف‌تری تولید می‌کنند (Tsumura et al., 1996; Nagaoka and Ogihara, 1997). چون آغازگرها توالی‌های ساده تکراری با توزیع و فراوانی متفاوت در ژنوم هستند بر تولید باند در گونه‌های مختلف تاثیر می‌گذارند. با در نظر گرفتن دی و تری نوکلئوتیدها در کنار هم یک توالی ساده تکراری یا ISSR در هر ۳۳ کیلو باز از توالی DNA هسته‌ای در مقایسه با ۴۲۳ کیلوباز از توالی DNA اندامی وجود دارد (Wang et al., 1994). در کل آغازگرهایی با توالی(CA)، (AC)، (TC)، (CT)، (GA)، (AG) چند شکلی بیشتری در مقایسه با دی، تری و تترانوکلئوتیدها از خود نشان می‌دهند. توالی A+T فراوان‌ترین دی‌نوکلئوتید در گیاهان هست. تری و تترانوکلئوتیدها فراوانی کمتری در مقایسه با دی‌نوکلئوتیدها داشته و کمتر در مطالعات استفاده میشوند.
توالی‌های AG و GA باندهای شفافی در مطالعه برنج و نخود تولید می‌کنند (Joshi et al., 2000;Reddy et al., 2000; Sarla et al., 2000; Ratnaparkhe et al., 1998) در حالی که آغازگرهای مبتنی بر AC در سیب زمینی و گندم کارایی بهتری دارند (Nagaoka and Ogihara, 1997; Kojima et al., 1998;).
قدرت حل (Rp) شاخصیست که برای مقایسه ارزش آغازگرهای مختلف از لحاظ باندهای اطلاعات دهنده بدست آمده از سری بانک ژن توسعه یافت (Provest and Wilkinson, 1999).
۲-۱۱-۳- روش کشف
سطح چند شکلی کشف شده، نشان داده شده که با روش کشف مورد استفاده متفاوت است. الکتروفورز روی ژل اکریلامید در ترکیب با رادیواکتیویته حساس‌ترین است و در جایگاه دوم ژل اکریلامید رنگ‌آمیزی شده با نیترات نقره قرار دارد. ژل آگارز و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید در جایگاه سوم قرار می‌گیرد. کاربرد ژل اکریلامید تعداد باندهای به مراتب بیشتری را در مقایسه با آگارز نشان داد (Moreno et al., 1998). در مطالعه نارنگی سه برگه رنگ آمیزی نیترات نقره همه باندهای کشف شده با اتورادیوگرافی را نشان داد (Fang et al., 1997). با وجود این سطح بالای چند شکلی کشف شده حتی وقتی که فراورده‌های تکثیر ISSR روی ژل آگارز بدون نشاندار شدن استفاده شد مشاهده گردید. بنابراین نیاز به رادیواکتیویته می‌تواند اجتناب شود وقتی که نمونه‌های بسیاری از بانک ژن مطالعه میشوند. ISSR-PCR تکنیک موثره سریع، ساده با تکرارپذیری بالاست که در آن کاربرد رادیواکتیویته لازم نیست. آغازگرهای اختصاصی آن به راحتی سنتز میشوند و تفاوت در طول و توالی آن امکان‌پذیر است. فراورده‌های تکثیر شده معمولاً ۲۰۰۰-۲۰۰ جفت باز طول دارند و بوسیله الکتروفورز آگارز و اکریلامید نتیجه مناسب را ارائه می‌دهند.
۲-۱۲- کاربردهای تکنیک ISSR
۲-۱۲-۱- انگشت‌نگاری ژنتیکی
انگشت‌نگاری DNA ابزار مهمی برای دسته بندی بانک ژن و استقرار شباهت در میان واریته‌ها، هیبریدها و منابع والدینی در مدیریت بانک ژن و برنامه‌های اصلاح نژاد میباشد. آغازگرهای دی‌نوکلئوتید ISSR انکورد شده در یکی از دو انتهای َ۳ یا ۵َ در مطالعه انگشت‌نگاری با تکرارپذیری بالا برای حفظ مجموعه گیاه کاکائو استفاده شده است (Charters and Wilkinson, 2000). تکنیک ISSR چند شکلی مناسبی برای تمایز واریته‌های مختلف گل داوودی نشان داد ((Wolf et al., 1998.
۲-۱۲-۲- تنوع ژنتیکی و آنالیز فیلوژنتیکی
تکنیک ISSR به طور موفقیت آمیزی برای تخمین تنوع ژنتیکی در سطح درون و بین گونه‌ای طیف وسیعی از گونه‌های گیاهی همچون برنج (Joshi et al., 2000)، گندم (Nagaoka and Ogihara, 1997)، سیب زمینی، بارهنگ (Wolf and Morgan-Richards, 1998) و ارزن انگشتی ((Salimath et al., 1995 و گونه‌های جانوری استفاده شد. آغازگرهای توالی‌های ساده تکراری انکورد شده مفیدتر و تکرارپذیرتر از ایزوزایم‌ها، RAPD و RFLP در تجزیه تنوع بانک ژن پرتقال سه برگه معرفی شد (Fang et al., 1997). ISSR برای تجزیه تنوع در جنس Elusine به لحاظ کمی و کیفی نسبت به نشانگرهای RAPD و RFLP برتری داشت (Salimath et al., 1995). به طور معنی‌داری تکنیک ISSR در سطح گونه کارایی مناسبی برای تمایز واریته‌ها از خود نشان داد برای مثال ۵ آغازگر انکورد شده در انتهای ۵ توانستند ۲۰ کالتیوار Brassica napus را از یکدیگر متمایز سازند (Charters et al., 1996).
۲-۱۲-۳- نقشه‌یابی ژنتیکی
اکثر مطالعات نقشه‌یابی ژنتیکی بروی گیاهان استوار است، با بهره گرفتن از تکنیک‌های ISSR، RAPD و Isozyme موفق به کشف نقشه ژنی شاه‌بلوط شدند (Casasoli et al., 2000) و همچنین کاربرد نشانگرهای RFLP، RAPD و ISSR برای نقشه یابی کاج سیاه ژاپنی و اروپایی (Arcade et al., 2000)، مشخص کرد که نشانگرهای ISSR و RAPD به لحاظ کیفی نسبت به Isozyme برتری دارند(Casasoli et al., 2000) .
۲-۱۲-۴- تعیین فراوانی توالی‌های ساده تکراری (SSR)
ISSR دیدگاه مناسبی جهت سازماندهی، فراوانی و سطح چند شکلی توالی‌های تکراری ساده متفاوت در ژنوم‌های گیاهی و جانوری ارائه می‌دهد. در گندم و برنج توالی‌های ساده تکراری دی‌‌نوکلئوتیدی به عنوان آغازگر استفاده و تعداد زیادی باند تولید کرد بنابراین نسبت به تکرارهایی با توالی ساده با واحدهای بزرگتر، عمومی‌تر هستند (Nagaoka and Ogihara, 1997). آغازگرهای GA انکورد شده در انتهای َ۳ پنج مرتبه باندهای بیشتری نسبت به توالی GT تولید می‌کنند که نشان دهنده فراوانی کم یا فقدان توالی GT میباشد. نشان داده شده است که توالی‌های تترانوکلئوتیدی در طول ژنوم یوکاریوت‌ها فراوانند (Gupta et al.,1994) و تترامر AGAC و GACA در ژنوم علف‌ها پخش شده‌اند (Pasakinskiene et al., 2000). توالی‌های تترانوکلئوتیدی در تمایز درون گونه‌ای مگس‌های Simuliidae عملکرد مناسبی داشتند (Dusinsky et al., 2006).
۲-۱۲-۵- مطالعه جمعیت‌های طبیعی و گونه‌زایی
نشانگر ISSR l معرفی شده تا در سیستماتیک و آزمایش فرضیه‌های گونه‌زایی مفید باشد (Wolf et al.,1998). منشا گونه Penstemon clevelandi با کاربرد تنها ۸ نشانگر ISSR شناسایی شد. کاربرد این تکنیک مولکولی در اکولوژی طیف زیادی از خانواده‌های گیاهی استفاده شده است که عبارتند از: Brassicacea، Orchidaceae، Poaceae، Violaceae، Hippocastanaceae، Scrophulariaceae و Asteraceae تفاوت‌های درون و بین جمعیتی را می‌توان با نشانگر چند جایگاه ژنی ISSR شناسایی کرد. نشان داده شده است میزان تفاوت بین جمعیت‌های O. granulate از نواحی مختلف (۲/۴۹ درصد) بیشتر از تفاوت‌های جمعیتی درون یک ناحیه (۳۸ درصد) یا درون یک جمعیت (۱۲ درصد) با بهره گرفتن از نشانگر ISSR است (Qian et al., 2001).
۲-۱۳- چشم انداز کاربرد ISSR در ژنتیک مولکولی
نیاز به تنوع گونه‌های گیاهی و جانوری جهت توسعه و بهبود آن در اصلاح نژاد آینده بسیار با اهمیت بوده و نشانگر مولکولی ISSR بی‌شک نقش مهمی در این زمینه ایفا می‌کند زیرا این نشانگر قادر به تشخیص چندشکلی زیاد در گونه‌ها و واریته‌های نزدیک به هم بوده و در تمایز آنها کارایی خوبی دارد و می‌تواند در مقایسه با نشانگرهای دیگر ارزان‌تر و مفیدتر باشد ( Gupta et al., 1994; Salimath et al., 1995; Virk et al., 2000). در بسیاری از مطالعات به منظور تعیین چندشکلی و مقایسه سیستم‌های مولکولی برای مثال در گروه SSR از تری و تترانوکلئوتیدها استفاده می‌شود. چنین توالی‌هایی در مقایسه با دی‌نوکلئوتیدها نه تنها فراوان نیستند بلکه نمی‌توانند در دسته‌بندی واریته‌ها و گونه‌ها مفید باشند. داده‌های بسیاری با کاربرد توالی‌های SSR بدست می‌آید که در محدوده وسیع‌تری از ژنوم انتشار داشته باشند. با کاربرد ISSR با نشانگر RAPD میزان بیشتری چند شکلی قابل اکتشاف میباشد ((Joshi et al., 2000; Becker and Heun, 1995.
تکنیک ISSR بدون محدودیت نمی‌باشد برای مثال همچون RAPD ممکن است قطعات هم حرکت از نواحی غیر هومولوگ منشا و با هم حرکت کنند که ممکن است سبب ایراداتی در تخمین شباهت ژنتیکی گردد (Sanchez et al., 1996). طبیعت مولکولی چند شکلی تنها در صورتی شناخته می‌شود که قطعه استخراج شده از ژل توالی‌یابی شود. نشانگر ISSR متصل به صفات مهمی زراعی توالی‌یابی شد و در نشانگر STS برای انتخاب مارکر مناسب مورد استفاده قرار گرفت. یکی از مزایای ISSR در پیوستگی آنها با جایگاه‌های ژنی SSR میباشد. اگر چه ریزماهواره‌ها احتمالاً خودشان به طور انتخابی خنثی و بدون عمل می‌باشند پی برده شده که به نواحی کدکننده متصل هستند به همین دلیل ISSR احتمالاً نشان دهنده نواحی قوی ژنی می‌باشند (Kojima et al., 1998).
۲-۱۴- کاربرد نشانگر ISSR در حشره شناسی
مطالعات محدودی از کاربرد نشانگر ISSR در حشره‌شناسی چاپ شده است و عمده این مطالعات روی دو راسته بالپولکداران و دوبالان متمرکز بوده و دو مطالعه روی زنجره‌ها و شته‌ها از راسته جوربالان، دو مطالعه روی زنبور عسل از بال‌غشائیان، مطالعه‌ای روی سوسک کرگدنی از سخت بالپوشان صورت گرفته است. مطالعات صورت گرفته به شرح زیر می‌باشند:
مطالعه تنوع ژنتیکی زنجره Sogatella furcifera در چین (Liu et al., 2010).
مطالعه کاربرد نشانگر ISSR در تعیین تفاوت فردی و جمعیتی دو گونه شته Pemphigus obesinymphae و Acythosiphum pisum و یک گونه مگس موسکوئیت Aedes aegypti در آمریکا (Abbot, 2001).
بررسی چندشکلی ۳ جمعیت زنجرک جنس Homalodisca از خانواده Cicadellidae با نشانگر ISSR در آمریکا (De Leon and Walker, 2004).
مطالعه تنوع ژنتیکی دو گونه از مگس‌های جنس Mayetiola از خانواده Cecidomyiidae در تونس (Mezghani Khemakhem et al., 2005).
بررسی کاربرد نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی درون و بین گونه ای مگس‌های خانواده Simuliidae (Dusinsky et al., 2006).
کاربرد نشانگر ISSR در بررسی چندشکلی پروانه‌های خانواده Noctuidae (Hundsdoerfer and Wink., 2005).
کاربرد ISSR-PCR در فیلوژنیHyles euphorbiaecomplex از پروانه‌های خانواده Sphingidae (Hundsdoerfer et al., 2005).
مطالعه ساختار جمعیت‌های وحشی و نیمه اهلی کرم ابریشم Antherae mylitta با نشانگر ISSR (Kar et al., 2005; Liu et al., 2010).
تنوع ژنتیکی آفت سوسک کرگدنی خرما Oryctes rhinocerus از خانواده Scarabaeidae با نشانگر ISSR (Manjeri et al., 2011).
بررسی تنوع ژنتیکی کرم ابریشم دارای دیاپوز و فاقد دیاپوز با نشانگر ISSR و همراهی آن با برخی صفات اقتصادی در هند (Reddy et al., 1999; Velu et al., 2008; Chatterjee and Mohandas, 2003; Liu et al., 2010; Awashti et al., 2008).
ارزیابی ژنتیکی کرم ابریشم اری Samia Cynthia ricini و ردیابی جایگاه‌های مرتبط با کمیت و موقعیت جغرافیایی در هند (Pradeep et al., 2010; Liu et al., 2010).
بررسی نژادهای مختلف زنبور عسل مقاوم و حساس به کنه Varroa در امارات (Al-OItaibi, 2008; Paplauskiene et al., 2006).
در بخش کنه‌شناسی نیز مطالعات محدودی صورت گرفته است:
کاربرد نشانگر ISSR در تنوع ژنتیکی کنه Tyrophagus putrescentiae از خانواده Acaridae (Zhu et al., 2010)
آنالیز ژنتیکی زنبور Bombus hypocrita با بهینه کردن نشانگر ISSR (Geng et al., 2009)
۲-۱۵- نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یک روش سریع، آسان و نامحدود (Powledge, 2004) سنتز آنزیمی DNA در محیط بی‌جان[۵۹] است که در برگیرنده‌ی فرایندی از سیکل‌های تکراری با مرحله‌های مشخص و تعریف شده در هر سیکل است (معتمدی، ۱۳۸۵).
در این فرایند که تقلیدی از فراین همانند سازی DNA در طبیعت است، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده‌‌ی دو انتهای قطعه مورد نظر DNA هستند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می‌گیرند تا واکنش آنزیمی همانند سازی DNA در درون لوله آزمایش امکان‌پذیر شود. این همانند سازی فرایندی آنزیمی است و توسط انواع مختلفی از آنزیم‌های پلیمراز صورت می‌گیرد (نقوی و همکاران، ۱۳۸۸).
فصل سوم
مواد و روش‌ها
۳-۱- جمع آوری نمونه‌ها
برای انجام بررسی‌های ژنتیکی و مرفولوژیکی توده‌های زنبور عسل برخی از نواحی ایران، از پنج استان خوزستان، کردستان، مرکزی، اصفهان، فارس (شکل ۳-۱ و جدول۳-۱)، از بین زنبوردارانی که کوچ خارج از استان نداشته، دارای بیش ۵۰ کلنی و حدود سه سال یا بیشتر سابقه زنبورداری داشتند به صورت تصادفی از ۵-۳ کلنی، زنبور کارگر نمونه برداری انجام شد. نمونه برداری در فروردین و اردیبهشت ۱۳۹۱ انجام شد. از هر کلنی ۵۰ زنبور کارگر به صورت تصادفی توسط اسپیراتور جمع آوری شده و نمونه‌ها به ظرف حاوی یخ منتقل و تا زمان انتقال به آزمایشگاه نگهداری شدند (شکل ۳-۲).
شکل۳-۱: پنج استان جمع آوری نمونه‌ی زنبور عسل:۱- خوزستان ۲- کردستان ۳- مرکزی ۴- اصفهان ۵- فارس
جدول۳-۱: مکان و آدرس‌های محل نمونه برداری زنبور عسل
