Biomedical Engineering

آلمان

۲-۲- تهیه نمونه‌ها ی کفیر
از آنجا که در ایران فراورده کفیر فقط به صورت دوغ تولید می‌شوند و تنهاتولید کنندگان این فرآورده دوشرکت کاله وپگاه هستند،‌ در پاییز سال ۱۳۸۸ دو نمونه دوغ کفیر از شرکت‌ها ی کاله و پگاه خریداری شد و برای بررسی و انجام آزمایشات در یخچال نگهداری شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۳- تهیه میکروارگانیسم‌ها
باکتری‌ها ی مورد بررسی شامل Shigella.sonei, Salmonella.typhi ,E.coli O157, Listeria.monocytogenes،‌ Helicobacter.Pylori وVibrio.cholerae به صورت پودر freeze-dried از کلکسیون میکروبی دانشکده بهداشت دانشگاه تهران خریداری شد.
۲-۴- روش‌ها
۲-۴-۱- بررسی تعداد کل میکروارگانیسم‌ها ی موجود در دو نمونه کفیر به روش پور پلیت
به منظورسنجش تعداد کل میکروارگانیسم‌ها ی موجود در این دو نوع نمونه کفیر،‌ از روش متداول پور پلیت استفاده شد.‌برای اینکار از دو نوع محیط کشت مولر هینتون براث و پوتیتو دکستروز براث به تعداد لازم تهیه شد و از هر کدام ۱۰۰ میلی لیتر در ارلن‌ها ی استریل شده ریخته شد.‌سپس به هر کدام از ارلن‌ها ۱۰ میلی لیتر از نمونه‌ها ی کفیر جداگانه تلقیح شد و به مدت ۲۴ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۰ درجه سانتی گراد قرار داده شد.پس از ۲۴ ساعت که میکروارگانیسم‌ها ی کفیر در محیط‌ها ی مایع رشد کردند و رسوب شیری رنگی در ته ارلن مشاهده شد،‌ برای جداسازی و خالص سازی این میکروارگانیسم‌ها از این محیط مایع بر روی محیط جامد کشت می‌دهیم.‌برای این کار۱ میلی لیتر ازنمونه‌ها به لوله آزمایش حاوی ۹ میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل افزوده و بهم زده شد.مجددا به همین صورت رقت‌ها ی متوالی^[۳۴] از سوسپانسیون میکروبی تهیه شد (رقت‌ها ی ^۱- ۱۰،‌^۲-۱۰،‌ ^۳-۱۰،‌^۴- ۱۰ و ^۵- ۱۰ )یک میلی لیتر از هر رقت درون پلیت‌ها ی استریل ریخته شدو بر روی آنها ۲۰ سی سی محیطهای MHA و MRS وPDA استریل و مذاب به صورت جداگانه ریخته و با حرکت دورانی آرام بهم زده شد.پس از سفت شدن آگارپلیت‌ها ی حاوی محیط MRS تحت شرایط بی هوازی با بهره گرفتن از سیستم Gas Pak وجار بی هوازی در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و بقیه پلیت‌ها تحت شرایط هوازی در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت گرمخانه گذاری شدند.کشت‌ها ی میکروبی بعد از ۲۴ ساعت بوسیله دستگاه شمارشگر کلنی^[۳۵] شمارش گردید.
به منظور ایجاد شرایط بی هوازی از سیستم Gas Pak وجار بیهوازی استفاده شد: پلیت‌ها به صورت افقی داخل جار چیده شدند.به وسیله یک قطره آب نشانگر بی هوازی مرطوب گردیدو در قسمت بالای جار چنان آویزان شدکه منطقه واکنش بطور آزادانه در تماس با هوا باشد.یکی از بسته‌ها ی گازپک به صورت افقی نگه داشته و بوسیله استوانه مدرج ۳۵ میلی لیتر آب مقطر در طی زمان ۲۰-۱۵ ثانیه بطور یکنواخت به روی آن ریخته شد و بلافاصله داخل جارگذاشته شد، به صورتی که سمت چاپدار بسته به سمت پلیت‌ها قرار گیرد.سپس سریعا در جار به هوازی بسته شد ودردمای مورد نظر قرار گرفت.
از رنگ آمیزی گرم جهت مشاهده شکل ظاهری میکرو ارگانیسم‌ها ی جدا شده از کفیر در زیر میکروسکوپ استفاده شد[۳۶].
۲-۴-۲- انجام آزمایش‌ها ی شناسایی برای باکتری‌ها ی جدا شده از کفیرها
پس از انتخاب کلنی برای نمونه‌ها ی باکتریایی تست کاتالاز و کشت در محیط SIM , TSI قندهای مختلف ( بر اساس تستهای شیمیایی موجود در کتاب برگی برای شناسایی لاکتوباسیل‌ها [۳۷]) انجام شد.برای انجام آزمایش‌ها ی قندی،‌ پس از ساختن محیط پایه MRS و پخش کردن آنها در لوله‌ها ی آزمایش ۱۳ قند مختلف شامل قندهای : آرابینوز، سلولوز، فروکتوز، گالاکتوز، گلوکز،‌ لاکتوز،‌ مالتوز،‌ مافوز،‌ رافینوز، سالیسین،‌ سوربیتول،‌ سوکروز،‌ گزیلوز به هر گونه به طور جداگانه اضافه شد.به میزان% w/v 1 به هر کدام از لوله‌ها باکتری را تلقیح شد،‌ برای هر نمونه قند لوله‌ها ی شاهد هم در نظر گرفته شد.‌سپس انکوباتور گذاری شد(دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت).‌
۲-۴-۳- شمارش میکروارگانیسم‌ها ی کفیر از زمان تولید تا مصرف
برای بررسی پایداری میکروارگانیسمهای موجود در کفیر از زمان تولید تا مصرف از همان روش متداول پورپلیت(روش توضیح داده شده در قسمت یک) استفاده شد.‌از دو نمونه کفیر با تاریخ مصرف صفر یعنی اولین روز تولید تهیه شده،‌ تاریخ مصرف دوغ‌ها ۱۵ روز می‌باشد.‌محیط‌ها ی جامد اختصاصی لاکتوباسیل(MRS) و مخمر(PD) موجود در کفیر را تهیه کرده،‌ رقتهای مختلف کفیر را در آنها تلقیح شد،‌ پس ازسفت شدن محیط‌ها، انکوباتور گذاری شد و روز بعد میکروارگانیسم‌ها ی رشد یافته در محیط شمارش شد.‌این کار را هر ۴۸ ساعت تا پایان تاریخ انقضای هر کدام از نمونه‌ها تکرار شد.
۲-۴-۴- تعیین میزان اسیدیته کفیرها از زمان تولید تا مصرف
بدین منظور از زمان شروع تاریخ مصرف نمونه‌ها ی دوغ تا پایان آن زمان،‌ pH نمونه‌ها با دستگاه pH meter اندازه گیری شد.
۲-۴-۵- بررسی مقاومت میکروارگانیسم‌ها ی کفیر در مقابل pH و املاح صفراوی
ابتدا محیطهای پایه PDB , MRS به میزان مناسب ساخته شد و در لوله‌ها ی آزمایش پخش شدو با HCl و NaOH به pH مناسب رسید.۱/۰ میلی لیتر از سوسپانسیون باکتریهای جدا شده در کفیر به لوله‌ها تلقیح شد.‌برای هر pH لوله شاهد هم تهیه می‌شود و پس از ۲۴ ساعت رشد یا عدم رشد را مورد بررسی قرار گرفت.‌
برای نمکهای صفراوی هم همین کار را انجام شد .‌محیطهای پایه MRS را ساخته شدو در لوله‌ها ی آزمایش پخش شد،‌ سپس به ترتیب در لوله‌ها غلظتهای مختلف نمکهای صفراوی از ۱/۰،‌ ۲/۰،‌ ۳/۰ تا ۱ گرم اضافه شد و پس از آن ۱/۰ میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری‌ها به لوله‌ها تلقیح شد و پس از ۲۴ ساعت رشد یا عدم رشد را مورد بررسی قرار گرفت.‌برای هر کدام از رقت‌ها ی نمک صفراوی شاهد نیز تهیه گردید.
۲-۴-۶- بررسی توانایی بازدارندگی میکروارگانیسم‌ها ی مختلف توسط نمونه‌ها ی کفیر
در این مرحله لازم است برای هر میکروارگانیسم زمان مرگ^[۳۶] در کفیر را بدست آید.‌برای این کار ۱ mL از سوسپانسیون باکتریایی معادل ۵/۰ مک فارلند در mL100 از نمونه‌ها ی دوغ کفیر تلقیح شد و در گرمخانه نگهداری شد و هر ۳۰ دقیقه یکبار قبل از ۲ ساعت و بعد از آن در زمان‌ها ی ۲،۴،۶،۸،۱۰،۱۲و ۲۴ ساعت پس از تلقیح باکتری به کفیر،‌ رقت‌ها ی سریالی تهیه کرده و در محیطهای کشت اختصاصی هر باکتری از این رقتها کشت داده شد پس از طی مدت زمان لازم برای رشد هر باکتری،‌ شمارش‌ها انجام شد.
۲-۴-۶-۱- باکتری ویبریوکلرا
mL 1 از سوسپانسیون باکتری ویبریو معادل ۵/۰ مک فارلند را در mL 100از هر کدام از نمونه‌ها ی کفیر تلقیح کرده و به مدت نیم ساعت انکوباتورگذاری شد و پس از آن از نمونه تلقیح شده (رقت‌ها ی ^۱- ۱۰،‌^۲-۱۰،‌ ^۳-۱۰،‌^۴- ۱۰ و ^۵- ۱۰ ) را تهیه کرده و روی محیط کشت اختصاصی ویبریو( TCBS ) کشت داده شد.‌ پلیت‌ها انکوباتورگذاری شد و جواب‌ها را بطور جداگانه پس از ۲۴ ساعت مورد بررسی قرار گرفت.
۲-۴-۶-۲- لیستریامونوسایتوژنر
این باکتری برای رشد به محیط آگار خون دار احتیاج دارد.‌پس از تلقیح ۱mL سوسپانسیون باکتری به
mL 100 نمونه‌ها ی کفیر و پس از سپری شدن نیم ساعت از زمان تلقیح،‌رقت‌ها ی ^۱- ۱۰،‌^۲-۱۰،‌ ^۳-۱۰،‌^۴- ۱۰ و ^۵- ۱۰ از نمونه‌ها را تهیه می‌کنیم و با بهره گرفتن از میله شیشه ای از هر کدام از این رقتها روی سطح محیط Blood Agarکه از قبل تهیه شده بطوریکنواخت رقت‌ها را پخش می‌کنیم^[۳۷].
۲-۴-۶-۳- اشرشیاکلی O157:H₇
Ml 1 از سوسپانسیون باکتری اشرشیاکلی معادل ۵/۰ مک فارلند را در mL 100از هر کدام از نمونه‌ها‌ی کفیر تلقیح کرده و به مدت نیم ساعت انکوباتورگذاری می‌کنیم و پس از آن از نمونه تلقیح شده رقت‌های ^۱- ۱۰،‌^۲-۱۰،‌ ^۳-۱۰،‌^۴- ۱۰ و ^۵- ۱۰ را تهیه کرده و روی محیط کشت اختصاصی این باکتری یعنی مکانکی آگارکشت می‌دهیم.‌پلیت‌ها را انکوباتورگذاری کرده و جوابها را بطور جداگانه پس از ۲۴ ساعت بررسی می‌کنیم.
۲-۴-۶-۴- سالمونلا تیفی
ml 1 از سوسپانسیون باکتری معادل ۵/۰ مک فارلند را در mL 100 از هر کدام از نمونه‌ها ی کفیر تلقیح کرده و به مدت نیم ساعت انکوباتورگذاری میکنیم و پس از آن از نمونه تلقیح شده رقت‌ها ی ^۱- ۱۰،^۲-۱۰،‌ ^۳-۱۰،‌^۴- ۱۰ و ^۵- ۱۰ را تهیه کرده و روی محیط کشت اختصاصی این باکتری یعنی بیسموت سولفیت آگارکشت می‌دهیم.‌پلیت‌ها را انکوباتورگذاری کرده و پس از ۲۴ ساعت نتایج را بررسی می‌کنیم.
۲-۴-۶-۵- شیگلا سونئی
ml 1 از سوسپانسیون باکتری شیگلا معادل ۵/۰ مک فارلند را در mL 100از هز کدام از نمونه‌ها ی کفیر تلقیح کرده و به مدت نیم ساعت انکوباتورگذاری میکنیم و پس از آن از نمونه تلقیح شده رقت‌ها ی ^۱- ۱۰،‌^۲-۱۰،‌ ^۳-۱۰،‌^۴- ۱۰ و ^۵- ۱۰ را تهیه کرده و روی محیط کشت اختصاصی این باکتری یعنی (s.s agar)کشت میدهیم،.‌پلیت‌ها را انکوباتورگذاری کرده و جوابها را بطور جداگانه پس از ۲۴ ساعت بررسی می‌کنیم.
۲-۴-۶-۶- هلیکو باکتر پیلوری
این باکتری برای رشد به محیط آگار خون دار احتیاج دارد.‌پس از تلقیح mL 1 سوسپانسیون باکتری به mL100نمونه دوغ و پس از سپری شدن نیم ساعت از زمان تلقیح در انکوباتورCO₂،‌ رقت‌ها ی ^۱- ۱۰،‌^۲-۱۰،‌ ^۳-۱۰،‌^۴- ۱۰ و ^۵- ۱۰ از نمونه‌ها را تهیه می‌کنیم و با بهره گرفتن از میله شیشه ای از هر کدام از این رقتها روی سطح محیط Blood Agar که از قبل تهیه شده بطور یکنواخت رقتها را پخش می‌کنیم ۰
فصل سوم
نتایج
۳-۱- تعداد کل میکرو ارگانیسم‌های موجود در نمونه‌های کفیر
پس از شمارش میکروارگانیسم‌های جدا شده از نمونه‌های کفیرکه بر روی سه محیط MHA,MRS,PDA کشت داده شده بود نتایج زیر بدست آمدکه در جدول ۳-۱ آمده است.
جدول ۳-۱ تعداد میکروارگانیسم‌ها ی موجود در نمونه‌ها ی کفیر

نمونه‌ها ی کفیر
محیط کشت

کفیر۱

کفیر۲

MHA

cfu/ml10⁴*4/1

cfu/ml 10⁴*7/1