۱-۱۰- روش‌های مختلف اسانس‌گیری
استخراج مواد مؤثر گیاهی، از قرن نوزدهم آغازگردید. دلایل استخراج مواد مؤثرگیاهی و خالص‌سازی و به‌ کارگیری آن‌ها در فرمولاسیون‌های دارویی را می‌توان در موارد زیر خلاصه نمود:

• • عدم امکان نگهداری گیاهان به مدت طولانی.

• • عدم دسترسی سریع به منابع گیاهی.

• • عدم معیار معینی به منظور مقدار مصرف و تجویز آن به بیمار.

نخستین بار دلاکروکس در سال ۱۸۸۱ اولین اندازه‌گیری جهت تعیین خواص آنتی میکروبیال اسانس‌ها را انجام داد (قاسمی دهکردی و همکاران،۱۳۸۷).
روش‌های مختلفی برای استخراج اسانس‌ها وجود دارد که در زیر به برخی از مهم‌ترین روش‌ها اشاره می‌کنیم:

۱-۱۰-۱- تقطیر با آب
در مورد گیاهانی به‌کار می‌رود که خشک باشند و در اثر جوشانیدن با آب از بین نروند. مانند اسانس تربانتین در برگ و ساقه‌های کاج.
۱-۱۰-۲- تقطیر با آب و بخار^[۲]
در مورد گیاهانی کاربرد دارد که ممکن است در اثر آب جوش فاسد شوند (خشک یا تازه)، در مورد مواد خشک (دارچین و میخک) ابتدا مواد گیاهی را آسیاب کرده با آب مخلوط می‌کنند به‌طوری‌که در داخل آب قرار گیرند سپس جریان بخار را از داخل مواد خیس شده عبور می‌دهند.
۱-۱۰-۳- تقطیر با بخار مستقیم^[۳]
در مورد گیاهان تازه اسانس‌دار به کار می‌رود.گیاهان را به ‌طور مستقیم، پس از جمع‌ آوری به داخل دستگاه تقطیر وارد می‌نمایند طی تقطیر با بخارآب، بعضی از ترکیبات اسانس‌ها هیدرولیز می‌شوند و برخی دیگر در اثر حرارت بالا تجزیه می‌گردند. بنابراین تقطیر مطلوب برای جمع‌ آوری اسانس‌ها باید طوری باشد که فشار بخار با شدت زیاد به داخل بافت‌ها و یاخته‌های گیاهی نفوذ کند تا تجزیه مواد اسانس به حداقل برسد (واترامین و هی ، ۱۳۷۹)^[۴].
۱-۱۰-۴- روش آنزیمی
اسانس‌های گلیکوزیدی (اسانس بادام تلخ و اسانس خردل) را به وسیله هیدرولیز آنزیمی گلیکوزیدی مربوطه به‌دست می‌آورند. در مغز بادام تلخ در اثر عمل امولسیون بر روی آمیگدالین اجسام مختلفی حاصل می‌گردند که از بین آن‌ها می‌توان اسانس را به روش تقطیر مجزا نمود. در دانه‌های خردل سیاه، گلیکوزید سینگرین به‌وسیله آنزیم میروزین هیدرولیز می‌شود و اسانس خردل را تولید می‌کند (امید بیگی، ۱۳۷۷).
۱-۱۰-۵- روش فشردن در حرارت معمولی
بعضی از اسانس‌ها در اثر تقطیر تجزیه می‌گردند، از این رو، آن‌ها را به وسیله فشار (اسانس لیمو و اسانس مرکبات) یا به روش‌های مکانیکی دیگر به دست می‌آورند (زارع زاده، ۱۳۸۳).
۱-۱۰-۶- استخراج به کمک حلال
در مواردی که اسانس موجود در بافت‌های تازه گیاهی (گلبرگ‌ها) به اندازه‌ای کم است که استخراج به طریق دیگر مشکل بوده و یا امکان‌پذیر نیست به‌کار می‌رود. در صنایع عطرسازی قسمت اعظم اسانس‌ها را به روش استخراج و با بهره گرفتن از حلال‌های آلی مانند اتر و نفت یا بنزین به‌دست می‌آورند (دوازده امامی، ۱۳۸۶).
۱-۱۰-۷- استخراج به کمک گازها
یکی از روش‌های بسیار جدید است. اصول آن بر پایه میعان گاز CO₂ در حوالی نقطه بحرانی است. دی‌اکسیدکربن به حالت مایع قادر است مواد معطر را در خود حل نماید و در حالت گازی تشکیل دو فاز دهد (شاهرخی، ۱۳۷۵).
۱-۱۰-۸- تقطیر تجزیه‌ای
وسیله‌ای جهت به‌دست‌آوردن اسانس‌هایی است که دارای بوی سوخته می‌باشند، هنگامی که چوب یا رزین گیاهان تیره کاج را بدون وجود هوا حرارت دهند، در اثر تجزیه ترکیبات فرار متعددی حاصل می‌شود و توده باقی‌مانده عبارت از زغال خواهد بود و مواد معطر تقطیر شده به دو لایه آبکی حاوی الکل متیلیک (عرق چرب) و پیرولیگنو (اسید استیک ناخالص) و لایه تیره رنگ دیگر محتوی قطران کاج و ترکیب‌های دیگر است که ترکیب آن به نوع چوب به‌کار برده شده (خرد یا آسیاب شده باشد)، بستگی دارد و باید بی‌درنگ به آن حرارت دهند. مقدار قطران حاصل معادل ۱۰% چوب به‌کار برده شده خواهد بود (مومنی و شاهرخی، ۱۳۷۷).
۱-۱۰-۹- روش گاز کروماتوگرافی^[۵] و جرم سنجی^[۶]
۱-۱۰-۹-۱- روش کروماتوگرافی گازی
کروماتوگرافی گازی یکی از قدرتمندترین و فراگیرترین روش‌های تجزیه‌ی دستگاهی است که تاکنون از آن استفاده شده است و یک روش فیزیکی است که برای جداسازی و اندازه‌گیری اجزای فرار به‌کار می‌رود. این روش برای اولین بار در سال ۱۹۵۲ توسط جیمز و مارتین استفاده گردید. در این نوع کروماتوگرافی فاز متحرک یک گاز است. فاز ساکن یک ماده جاذب جامد یا مایع پوشش داده شده و یا دارای پیوند با یک جامد روی دیواره ستون است. اگر فاز ساکن جامد باشد، روش را کروماتوگرافی گاز جامد (GSC) و اگر فاز ساکن مایع باشد، روش را کروماتوگرافی گاز-مایع (GLC) می‌نامند. بخش‌های مختلف یک دستگاه کروماتوگرافی گازی در شکل ۱-۱ نشان داده شده است (حسن زاده، ۱۳۸۴).
شکل ۱-۱ نشانگر بخش‌های مختلف یک دستگاه کروماتوگرافی گازی می باشد (عمّاری، ۱۳۸۸).
گاز حامل باید یک گاز بی‌اثر باشد تا با فاز ساکن یا نمونه واکنش ندهد. به همین علت به‌طور معمول از نیتروژن یا هلیوم استفاده می‌کنند. ابتدا گاز بی‌اثر از دستگاه عبور می‌کند سپس مقدار مشخص از مخلوط مورد آزمایش به وسیله سرنگ مخصوص وارد قسمت تزریق نمونه می‌شود. جدا شدن مواد در ستون مانند فرایند استخراج است. نمونه که در فاز گاز محلول است از بالای ستون وارد می‌شود و اجزا آن بر حسب ضریب توزیع خود بین دو فاز مایع و گاز تقسیم می‌شود. در نتیجه اجزای موجود در نمونه بر حسب تمایلی که ستون برای نگهداری آن‌ها دارد از یکدیگر جدا شده و به وسیله عبور گاز حامل، اجزا جدا می‌شوند و به ترتیبی که متناسب با عکس تمایل نگهداری ستون برای آن‌هاست، از انتهای ستون خارج شده، وارد آشکارساز می‌شوند. در آشکارساز اجزا جدا شده موجود در گاز حامل مورد شناسایی و اندازه‌گیری قرار می‌گیرند. دمای ستون دستگاه کروماتوگراف گازی را می‌توان روی دمای خاصی تنظیم کرده و به صورت هم دما جداسازی را انجام داد. همچنین در برخی موارد که اجزا نمونه در ستون به راحتی جدا نمی‌شوند، برای جداسازی بهتر از روش برنامه‌ریزی دمایی استفاده می‌شود. در این روش دمای ستون را طبق برنامه‌ای که از پیش تعیین شده و با سرعتی مناسب افزایش می‌دهند تا مواد به تدریج از یکدیگر جدا شوند (امامی، ۱۳۸۳).
۱-۱۰-۹-۲- طیف سنج جرمی
طیف سنج جرمی دستگاهی است که مولکول‌های گازی باردار را بر اساس جرم آن‌ها دسته‌بندی می‌کند، در داخل دستگاه خلایی به میزان mmHg^6-10- ^۵-۱۰برقرار است. مقدار کمی از نمونه توسط یک لوله از دریچه کوچکی وارد منبع یونش می‌شود. نمونه در اثر گرما و خلأ موجود به صورت گاز درآمده و با جریانی از الکترون‌های پر انرژی به طرف آند مقابل شتاب گرفته و جذب آن می‌شود. در اثر بمباران الکترونی جزئی از مولکول‌های نمونه یونیزه می‌شود. یون‌های مثبت حاصله از طریق شتاب‌دهنده و نیروی دافعه قطب مثبت آن و همچنین به دلیل تفاوت فشار موجود بین محل ورود نمونه و فضای سمت راست دستگاه به سمت روزنه کوچکی هدایت شده و پس از گذشتن از آن جریان یون‌ها از بین دو قطب یک آهن‌ربای قوی که جهت میدان آن عمود بر مسیر یون‌ها است عبور می‌کند. کاتیون‌های موجود به نسبت جرم بر بار (m/e) منحرف شده و از یکدیگر جدا می‌شوند. شکل ۱-۲ نمایی از این دستگاه را نشان می‌دهد.
شکل ۱-۲ نمای کلی دستگاه طیف سنج جرمی (عمّاری، ۱۳۸۸).
ذره‌های جدا شده پس از برخورد با یک صفحه عکاسی به صورت خطوطی ظاهر می‌شوند. دستگاه طیف سنج جرمی، مولکول‌ها و یون‌های گازی باردار را بر حسب جرم آن‌ها در میدان آهن‌ربایی از یکدیگر جدا و اندازه‌گیری می‌کند. طیف جرمی حاصل جهت تعیین وزن مولکولی دقیق، شناسایی اجسام و تعیین درصد ایزوتوپ ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.
در دستگاه GC-MS اجزای یک مخلوط به ترتیب توسط یک ستون کروماتوگرافی گازی که پیش از این توضیح داده شد از هم جدا شده و پس از حذف گاز حامل، وارد منبع یونش طیف سنج جرمی می‌شوند (شکل ۱-۳)
شکل ۱-۳ – نمونه ای از یک کروماتوگرام را نشان می دهد (عمّاری، ۱۳۸۸).
فصل دوم
سوابق تحقیق
۲-۱- مطالعات انجام شده بر روی گونه‌های Ferula در ایران
خانواده چتریان گیاهانی معطر هستند که تقریبا شامل ۳۷۰۰ گونه در ۴۳۴ جنس هستند. بیش از ۳۱۶ گونه از این خانواده در ایران شناخته شده است که ۲۵% بومی هستند. برخی از گونه‌های این خانواده به‌دلیل اهمیت در مصارف پزشکی و دارویی در تجارت جهانی اهمیت زیادی دارند(نبوی و همکاران، ۲۰۱۱).
گیاهان دارویی و اسانس‌دار خانواده چتریان به‌دلیل انعطاف اکولوژیکی بسیار زیاد نسبت به اقلیم‌های متنوع به عنوان یکی از ذخایر ژنتیکی مهم گیاهی محسوب می‌شوند(عرب‌زاده و همکماران، ۱۳۹۲).
آنغوزه گیاهی است بوته ای از خانواده چتریان (Umbelliferae) که معمولا در مناطق جنوبی ایران یافت می‌شود(نجف پور و همکاران،۱۳۸۱).
آنغوزه با نام علمی Ferula assa-foetida L. از گیاهان دارویی مهم تیره چتریان(Apiaceae) می‌باشد. این گیاه چند ساله ، دارای برگ‌های کرکدار و ساقه‌ای به طول ۲۰۰-۱۰۰ سانتی‌متر است. گل‌آذین کم و بیش فشرده، گلبرگ‌ها زرد رنگ و فاقدکرک هستند. میوه شیزوکارپ مسطح می‌باشد(رجبیان و همکاران، ۱۳۸۶).
آنغوزه گیاه بومی ایران و قسمت‌هایی از افغانستان است. استان‌های فارس، کرمان، خراسان، یزد، سمنان، هرمزگان، سیستان و بلوچستان، اصفهان، لرستان، کهکیلویه و بویراحمد و بوشهر به عنوان رویش‌گاه های اصلی این گیاه می‌باشند(رجبیان و همکاران، ۱۳۸۶).
در اثر تیغ زدن پایین ساقه و ریشه تازه آنغوزه، صمغی به نام(oleo gum-resin)از نوع اولئوگام رزین به رنگ زرد روشن یا قهوه‌ای تراوش می‌شود. نوع مرغوب آنغوزه دارای ۶۲% رزین، ۲۵% صمغ، ۳-۷% اسانس، فرولیک اسید^[۷] آزاد ۱/۲۸% و به مقدار بسیار جزیی وانیلین می‌باشد. همچنین دو ترکیب جدید آزافوئتیدین(assa-foetidin) و فروکولیسین(ferocolicin)از گروه کومارین‌های سزکوئی ترپنوئیدی از رزین صمغ آنغوزه جداسازی گردیده است(رجبیان و همکاران، ۱۳۸۶).
آنغوزه جهت تهیه داروهای ضد انگل، ضد تشنج، قاعده آور و مقوی قلب مورد استفاده قرار می‌گیرد و در رفع بیماری‌های دارای منشأ عصبی دستگاه تنفسی، اسپاسم حنجره، آسم، دستگاه گوارش و رفع یبوست افراد مسن مؤثر است(رجبیان و همکاران، ۱۳۸۶).
خاستگاه آنغوزه استپ‌های ایران و قسمت‌هایی از افغانستان می‌باشد. در ایران فلات مرکزی و مناطق کویری تا سلسله جبال زاگرس در استان‌های فارس، کرمان، خراسان، یزد، سمنان، هرمزگان، سیستان و بلوچستان، اصفهان، لرستان، کهکیلویه و بویر احمد و بوشهر به عنوان رویشگاه اصلی این گیاه ذکر شده‌اند این گیاه در نواحی بایر، زمین‌های ماسه‌ای خشک و حاوی ترکیبات آهکی مناطق گرم در ارتفاع۲۴۰۰-۱۹۰ متر بالاتر از سطح دریا و در مناطقی با پستی و بلندی زیاد در شیب های۷۰-۱۵ درصد با میزان بارندگی در حدود ۳۵۰ – ۲۵۰ میلی متر می‌روید(زارع کاریزی و همکاران، ۱۳۸۹)
از جنس Ferula بیش از ۱۳۳ گونه مختلف در آسیای مرکزی و نواحی مدیترانه‌ای پراکنده است. بیش از ۳۰ گونه از ۱۵ جنس آن در فلور ایران یافت می‌شود(نبوی و همکاران، ۲۰۱۱).
آنغوزه دارای خواص درمانی بسیار است و حتی در دامپزشکی نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد. در طب سنتی، از نظر طبیعت خیلی گرم و نسبتاً خشک است و در درمان بیماری‌هایی چون تشنج، فلج، رعشه، سستی اعضاء بسیار مفید است. همچنین از شاخ و برگ خشک شده آنغوزه در زمستان برای تغذیه دام استفاده می‌شود(محمودی و همکاران، ۱۳۸۹).
از نظر ترکیبات شیمیایی ریشه گیاه آنغوزه(F.assa foetida) دارای مواد آزارزیتوتانول، فرولیک اسید، اسانس روغنی فرار، پینن، آزولن، موسیلاژ، باسورین و … می‌باشد و در صمغ آنغوزه مقدار زیادی تانن(حدود ۶۰ درصد) و حدود ۲۰ درصد صمغ و ۵-۴ درصد اسانس وجود دارد در برخی گونه‌ها در نمونه‌های آنغوزه اشکی مقدار اسانس تا ۱۵ درصد نیز می‌رسد. تقریبا تمام این صمغ آنغوزه دارای ترکیبات دی, تری و تتراسولفید, مشتقات کومارینی فئوتیدین۳, کامولونفرول۴, اپی سامارکاندین۵, آمبلی پرنین، کانفرول۶ و … می باشد(امید بیگی و همکاران، ۱۳۸۳).